1.3. Флуоресцентные молекулярные роторы в оценке ответа клеток на фотодинамическое воздействие

Термин «молекулярные роторы» относится к соединениям, молекулы которых состоят из нескольких фрагментов, способных поворачиваться (вращаться) друг относительно друга. В большинстве случаев одну часть молекулы с большим моментом инерции рассматривают как неподвижную и называют статором, а другую часть молекулы, с меньшим моментом инерции — ротатором или, собственно, ротором [157].

Внутримолекулярное вращение осуществляется за счет энергии внешнего воздействия (света, электрического

поля, потока жидкости и т.п.).

Поглощение света молекулой флуоресцентного молекулярного ротора сопровождается первичным фотохимическим внутримолекулярным переносом электрона и образованием так называемого «комплекса с переносом зарядов» (ICT-состояние от англ. «intramolecular charge-transfer state») [114]. В соответствии с этим, в структуре молекулярного ротора можно выделить блоки донора и акцептора электронов, а также спейсерный блок, который образован одинарными или двойными связями и приводит донор и акцептор в сопряжение [114, 120]. Типичным примером донорной группы является алкилированный атом азота, а акцепторных групп — нитрильные и сложноэфирные группировки, а также ароматические циклы (рисунок 7).

Рисунок 7. Примеры структур молекулярных роторов


В основном невозбужденном состоянии для подавляющего большинства молекулярных роторов энергетически наиболее выгодной является плоская или почти плоская конфигурация. При фотовозбуждении молекулы вследствие переноса заряда от донора к акцептору возникает

несбалансированный вдоль оси молекулы дипольный момент. В отличие от невозбужденной молекулы, для ICT-состояния энергетически выгодной становится «скрученная» (англ. «twisted») конформация, получившая

название TICT-состояния (от англ. «twisted intramolecular charge-transfer state») [114, 120]. Схематично поведение энергетических уровней

молекулярного ротора в зависимости от угла поворота группы, обладающей наименьшим моментом инерции, представлено на рисунке 8.

Д — донор, А — акцептор, kF и k’F — константы перехода Si — So планарного и скрученного состояний, кл — константа перехода из возбужденного планарного в возбужденное скрученное состояние, kD — константа обратного перехода, 9 — угол поворота между донорной и акцепторной группами [ 120]


Уровень энергии для невозбужденного состояния молекулы в скрученном состоянии оказывается заметно выше, чем в основном состоянии, что обусловливает устойчивость последнего и определяет динамику переходов из скрученного состояния в основное. Напротив, в возбужденном состоянии наименьшей энергией обладает именно скрученное состояние, что, в свою очередь, обусловливает общую тенденцию к осуществлению поворота молекулы при фотовозбуждении. При этом

локальные минимумы энергетических состояний при возбуждении разделены потенциальным барьером, который должен быть преодолен для осуществления поворота [264]. Характерное время вращательного перехода в реальных системах составляет, как правило, менее 20 пс [224].

Релаксация молекулы из возбужденного состояния, таким образом, может происходить по двум различным сценариям: прямым переходом с уровня Si на уровень S0, при таком переходе, как правило, происходит излучение фотона флуоресценции, либо через TICT-состояние, с релаксацией между уровнями Si и S0 скрученного состояния и возвращением в основное состояние. В последнем случае, поскольку разница энергетических уровней возбужденного и невозбужденного скрученных состояний оказывается, как правило, меньше, чем разность S1-S0, релаксация в скрученном состоянии происходит с испусканием фотона, еще более сдвинутого в длинноволновую область, либо безызлучательным образом. Отношение квантовых выходов флуоресценции TICTи планарного (англ. «local excited») ^Le состояний можно записать [115, 224]:

где— константы перехода S1-S0 планарного и скрученного

состояний,— константа перехода из возбужденного планарного в

возбужденное скрученное состояние,— константа обратного перехода,

т’ст — время жизни скрученного состояния.

В подавляющем большинстве случаеввследствие чего

релаксация в скрученном состоянии оказывается доминирующей. В том случае, если молекулярный ротор испытывает безызлучательную релаксацию (что происходит, если разность энергий возбужденного и основного состояний в скрученном состоянии много меньше такой разности для планарной конфигурации), в спектре флуоресценции наблюдается единственная полоса [214], а ее интенсивность (квантовый выход) существенным образом зависит от свойств растворителя [111].

Важнейшим фактором, определяющим вероятность перехода в TICT- состояние, является вязкость растворителя [115]. В растворителях с низкой вязкостью релаксация происходит преимущественно из TICT-состояния. При высокой вязкости окружения вследствие стерических затруднений вращение отдельных фрагментов молекулы затруднено, поэтому дезактивация происходит из планарного состояния. Для роторов с единственной полосой излучения это отражается в увеличении времени жизни возбужденного состояния и квантового выхода флуоресценции [45, 167]. Связь квантового выхода флуоресценции ф молекулярного ротора с вязкостью ц описывается уравнением Фёрстера-Хоффмана [108]:

где z и а — константы, зависящие, соответственно, от параметров внешней среды и самого красителя.

В пионерской работе [108] значение для коэффициента а было получено аналитически при решении уравнения диффузии для трифениламинового красителя, в котором предполагалось вращение аминогрупп как твердых тел с известным моментом инерции. И теоретические, и экспериментальные результаты свидетельствовали о том, чтоПозже Р.О. Лоутфи [177,

178] получил более универсальное выражение, в котором коэффициент а мог зависеть и от параметров среды и принимать вполне произвольные значения.

Аналогичным образом представляется зависимость между вязкостью ц и временем жизни возбужденного состояния т:

где— константа скорости основного излучательного перехода, z — константа.

По разным источникам, на сегодняшний день для молекулярных роторов а определяется в диапазоне 0,5-0,75 [118, 137] или 0,33-0,67 [166, 261].

Помимо вязкости, необходимо отметить зависимость свойств

флуоресцентных молекулярных роторов от полярности растворителя [115, 176]. В полярных растворителях существенное увеличение дипольного момента молекулы при возбуждении приводит к переориентации молекул растворителя вокруг флуорофора с образованием водородных связей. Использование роторов с безызлучательной релаксацией TICT-состояния позволяет оценивать одновременно как полярность растворителя (по сольватохроматическому сдвигу максимума флуоресценции), так и его вязкость (по изменению времени жизни возбужденного состояния и квантового выхода).

Благодаря сильной зависимости флуоресцентных свойств от вязкости среды молекулярные роторы могут быть использованы в качестве люминесцентных сенсоров локальной вязкости в химических и биологических системах, в частности в клетках живых организмов, а также в качестве сенсоров динамических процессов, сопровождающих полимеризацию и конформационные изменения молекул белков [45].

К настоящему моменту доказано, что ряд заболеваний приводит к изменению вязкостных характеристик биологических жидкостей на клеточном уровне [179, 216, 260] и на уровне всего организма [212, 234]. Биомеханика клетки определяется преимущественно ее мембраной, цитоскелетом и цитоплазмой. В отличие от жесткого цитоскелета клетки, цитоплазма и мембрана имеют вязкоэластичные свойства, которые изменяются при различных патологиях. Так, вязкость клеточной мембраны определяется химическим составом бислоя, и ее изменения обусловлены вариациями связанных с мембраной энзимов и рецепторов [109, 202, 204]. Изменение вязкости плазмы крови и тканевой жидкости связано с различными заболеваниями [120, 157], которые в основном сопровождаются изменением уровня белка. Примером могут служить различные

инфекционные заболевания, заболевания сердечно-сосудистой системы [181], инфаркты [122, 245], гипертензия [142, 169], диабет [56, 190, 221, 246], атеросклероз [203], болезнь Альцгеймера [59, 73, 131], старение [73, 215].

Кроме того, повышение вязкости плазмы является одним из последствий курения [103], что может быть связью между курением и развитием сердечно-сосудистых заболеваний. Вязкость лимфатической жидкости непосредственно связана с вязкостью плазмы крови. Известно, что вязкость лимфатической жидкости увеличивается при раке молочной железы [65], а также во время острого шока [186].

Существует несколько подходов для измерения внутриклеточной вязкости. Наиболее распространенными являются методы, которые основаны на измерении анизотропии флуоресценции [231], восстановлении флуоресценции после фотообесцвечивания (англ. «fluorescence recovery after photobleaching» — FRAP) [89, 227] и использовании электронного

парамагнитного резонанса и ЯМР зондов.

Наиболее распространенный подход основан на зависимости анизотропии флуоресценции от вращательной диффузии флуорофоров и, тем самым, от вязкости. Оценку вязкости можно осуществить одним из двух способов. Первый позволяет измерять время вращательной корреляции по временной зависимости падения анизотропии, второй основан на измерении равновесной (стационарной) анизотропии при условии постоянного времени жизни возбужденного состояния зонда. В качестве зондов известно применение флуоресцеина [76, 123] и азидофлуоресцеина [218].

Сущность метода FRAP состоит в том, что в небольшом участке клетки зонд обесцвечивается в результате кратковременной мощной вспышки лазера. Затем регистрируется восстановление флуоресценции в участке, где происходило воздействие, которое обусловлено диффузией необесцвеченных молекул зонда из других областей клетки. По динамике этого процесса оценивают скорость диффузии данного типа молекул и, соответственно, вязкость [72].

Для определения внутриклеточной вязкости с помощью метода электронного парамагнитного резонанса применяют стабильные водорастворимые нитроксильные радикалы (спин-зонды). Если нитроксильный радикал находится в низковязкой среде, то его вращение является изотропным и достаточно быстрым, при этом наблюдается сигнал электронного парамагнитного резонанса, состоящий из трех узких симметричных линий. Увеличение вязкости среды приводит к изменению сигнала электронного парамагнитного резонанса спинового зонда [143].

Метод ЯМР-зондов во многом основан на тех же принципах, что и при использовании ЭПР. В качестве зондов могут быть использованы некоторые внутриклеточные молекулы. Например, обнаружено, что проксимальные остатки гистидина в молекулах миоглобина и гемоглобина имеют хорошо выраженные полосы поглощения в спектрах 1Н-ЯМР этих белков [174, 248].

Преимуществом использования молекулярных роторов является возможность получения карты вязкости (микровязкости) биологических объектов с субмикронным разрешением и отслеживание в динамике процессов, сопровождающихся изменением вязкости, на субклеточном уровне. Использование техники время-разрешенной микроскопии позволяет оценивать вязкостные характеристики субклеточных структур по измерению времени жизни возбужденного состояния флуоресцентного молекулярного ротора. При этом точность измерения вязкости с использованием молекулярных роторов сопоставима с точностью, достижимой при использовании механических реометров [57] или при использовании метода FRAP [198], а скорость измерения и пространственное разрешения оптического метода оказываются существенно выше, чем у механического [45]. Как следствие, молекулярные роторы могут быть использованы для наблюдения за процессами полимеризации белков [119, 222], изменения вязкости клеточных мембран [116, 117, 175], цитоскелета [135] и цитоплазмы [163, 179].

В 2009 году была опубликована работа [164], в которой для фотодинамического воздействия на клетки был применен краситель, объединяющий свойства фотосенсибилизатора и флуоресцентного молекулярного ротора. С помощью порфиринового димера, в котором тетрапиррольные циклы связаны бутадииновым линкером, было впервые продемонстрировано фотоиндуцированное увеличение вязкости клетки при фотодинамическом воздействии. Позднее теми же авторами было установлено, что для данного соединения продукция синглетного кислорода при фотовозбуждении также является процессом, контролируемым вязкостью среды [165]. На сегодняшний день это соединение остается единственным описанным в литературе фотосенсибилизатором со свойствами молекулярного ротора, однако, продемонстрированный подход открывает принципиально новые возможности для ФДТ. В частности, он делает возможным ранний контроль чувствительности клеток или опухолевой ткани к воздействию и позволяет оценить эффективность воздействия в ходе проведения процедуры или непосредственно по её окончании.


<< | >>
Источник: Шилягина Наталья Юрьевна. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕТРААРИЛТЕТРАЦИАНОПОРФИРАЗИНОВ В КАЧЕСТВЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ. 2014

Еще по теме 1.3. Флуоресцентные молекулярные роторы в оценке ответа клеток на фотодинамическое воздействие:

  1. Шилягина Наталья Юрьевна. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕТРААРИЛТЕТРАЦИАНОПОРФИРАЗИНОВ В КАЧЕСТВЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ, 2014
  2. 6.2. ОЦЕНКА УСТОЙЧИВОСТИ ОБЪЕКТА К ВОЗДЕЙСТВИЮ ПОРАЖАЮЩИХ ФАКТОРОВ
  3. ОЦЕНКА РИСКА ВОЗДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА ЗДОРОВЬЕ ЧЕЛОВЕКА
  4. Методология оценки воздействия загрязнения окружающей среды на здоровье населения
  5. Оценка предельно допустимых техногенных воздействий на объекты природы
  6. Методы оценки воздействия загрязнения окружающей среды на здоровье населения
  7. 1.5. Оценка параметров внешней среды при массовых пожарах и ее воздействие на людей, укрывающихся в защитных сооружениях
  8. ПРОТИВ КАРТЕЗИАНЦЕВ, О ЗАКОНАХ ПРИРОДЫ И ИСТИННОЙ ОЦЕНКЕ ДВИЖУЩИХ СИЛ (Ответ на соображения, высказанные г-ном Папеном в «Acta Eruditorum» в январе 1691 г.)
  9. ВОЗДЕЙСТВИЕ ГИДРОСФЕРЫ НА ЧЕЛОВЕКА Пути воздействия
  10. Открытие деления клеток
  11. 11.3. Воздействие химически опасных веществ на организм человека 11.3.1. Виды воздействия АХОВ на организм
  12. Фиксация молекулярного азота
  13. Молекулярно-генетические исследования.
  14. Первые описания клеток
  15. Выяснение невозможности «свободного образования» клеток
  16. Представления о способах возникновения клеток до начала 70-х годов
  17. ИЕРАРХИЯ КЛЕТОК-КОММУН
  18. Атомно-молекулярное учение. Основные законы химии
  19. Молекулярно-биологические основы психических заболеваний.
  20. ЛУЧШЕ НИКАК НЕ ОТВЕТИТЬ, ЧЕМ ОТВЕТИТЬ ГРУБОСТЬЮ