3.3. Исследование фармакокинетики и специфичности накопления в опухоли тетраарилтетрацианопорфиразинов в экспериментах in vivo

Помимо возможности вызывать фотоиндуцированную гибель клеток, потенциальные фотосенсибилизаторы должны обладать способностью селективно накапливаться в опухолевой ткани. Поскольку эта способность не может быть исследована на культурах клеток, нами были проведены эксперименты на животных-опухоленосителях.

На рисунке 39 представлены комбинированные изображения (фотографическое изображение с наложением флуоресцентного) животного после инъекции Pz(I) ПЩ в дозе 15 мг/кг. Хорошо видно, что уже через 30 минут после внутривенного введения Pz(I) ПЩ происходит появление хорошо различимого сигнала флуоресценции в области опухоли в диапазоне, соответствующем флуоресценции Pz(I). Многократное превышение уровня флуоресцентного сигнала в опухоли (выделена на рисунке белым пунктиром) по сравнению с окружающими нормальными тканями свидетельствует о селективности накопления препарата.

Для сравнения на рисунке 40 представлены комбинированные изображения животного после инъекции Pz(I) без солюбилизатора. Несмотря на общее увеличение сигнала флуоресценции, видимой разницы между участком опухоли и нормальными тканями не регистрируется.

Рисунок 40. Динамика накопления и выведения Pz(I) (15 мг/кг) в экспериментальной опухоли. Xex 605 нм, Xem 670-690 нм

Количественная оценка сигнала показала, что максимум накопления Pz(I) ПЩ достигался через 3-6 часов после инъекции, при этом наблюдалось длительное удержание красителя в опухолевой ткани (время полувыведения около 48 часов), в то время как в нормальных тканях (бедро) уже через сутки значения составляли менее половины от максимального уровня сигнала (рисунок 41а). Время полного выведения из нормальных и опухолевых тканей составило около 2 и более 6 суток, соответственно (рисунок 42). Значения контраста опухоль/нормальная ткань, по изображениям, полученным in vivo, составили ~2 в максимуме накопления и ~4 через 24 часа после инъекции. Некоторые параметры фармакокинетики для Pz(I) и Pz(I) ПЩ представлены в таблице 7.

В отличие от Pz(I) ПЩ, при введении красителя без солюбилизатора отсутствовали какие-либо различия в распределении красителя в опухоли и нормальных тканях животного. После увеличения сигнала флуоресценции наблюдали быстрое выведение красителя с периодом полувыведения не более 5-7 часов. Через сутки после инъекции в тканях животного оставалось лишь незначительное количество красителя, а контраста в накоплении в течение всего времени наблюдения не наблюдалось (рисунок 41 б).

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о том, что наночастицы на основе ПЩ обеспечивают селективность накопления Pz(I) в опухоли. Данный эффект может объясняться так называемым EPR-эффектом (от англ. «enhanced permeability and retention») [183], обусловленным повышенной проницаемостью несовершенного сосудистого русла опухоли для объектов нанометрового размера, а также их удержанием в опухоли за счет неразвитого лимфатического оттока.

	Рисунок 41. Изменение интенсивности сигнала флуоресценции в нормальных тканях (бедро) и опухолевых участках после введения фотосенсибилизатора: а — Pz(I) ПЩ, б — Pz(I)

Рисунок 42. Динамика накопления и выведения Pz(I) ПЩ в опухолевой и нормальных тканях при его внутривенном введении

При проведении экспериментов in vivo методом поверхностного флуоресцентного имиджинга значительное влияние на результат оказывает экранировка кожей сигнала от более глубоколежащих органов и тканей. В связи с этим для верификации результатов, полученных in vivo, нами была проведена оценка накопления Pz(I) в органах и тканях животных- опухоленосителей методами микроскопии ex vivo. По данным конфокальной микроскопии, Pz(I) проникал в глубину опухолевого узла и накапливался в цитоплазме клеток (рисунок 43).

Для Pz(I) ПЩ, а также для Pz(I), введенного без солюбилизатора, характерна схожая картина распределения по органам и тканям (рисунок 44). Наиболее высокий уровень флуоресценции регистрируется в образцах печени и легких. Достаточно яркая флуоресценция отмечается в селезенке и почках. Высокий уровень сигнала в легких, а, следовательно, высокая концентрация там порфиразина может свидетельствовать о потенциальной легочной токсичности исследуемых соединений. Отсутствие накопления порфиразина в образцах кожи позволяет предположить его низкую кожную фототоксичность.

Рисунок 43. Конфокальная флуоресцентная микроскопия образцов опухолевой ткани через 3 часа после введения фотосенсибилизатора (15 мг/кг, в/в).650-710 нм Размер изображений 75х75 мкм

Рисунок 44. Конфокальная флуоресцентная микроскопия образцов органов и тканей через 3 часа после введения фотосенсибилизатора (15 мг/кг, в/в). ’ "" ’- - Размер изображений 225x225 мкм а — Pz(I) ПЩ; б — Pz(I)

Результаты количественного анализа микроскопических данных подтвердили селективное накопление Pz(I) в опухоли по сравнению с мышцами и кожей. Контраст опухоль/мышцы через 3 часа после введения для Pz(I) ПЩ и Pz(I) составил 4 и 3 соответственно (рисунок 45).

Рисунок 45. уровень флуоресцентного сигнала в образцах нормальных и опухолевых тканей по данным конфокальной микроскопии