<<
>>

1.2. Механизмы внутриклеточного и внутритканевого распределения фотосенсибилизаторов

Изучение механизмов внутриклеточного и внутритканевого распределения фотосенсибилизаторов является важным этапом при разработке новых препаратов для ФДТ. Знание этих механизмов позволяет увеличить эффективность фотодинамического воздействия на патологические ткани, спрогнозировать токсические свойства ФС и, таким образом, минимизировать степень негативного воздействия на нормальные органы и ткани.

Поскольку основной эффектор фотодинамической терапии — синглетный кислород — за свое короткое время жизни (менее 0,04 мкс) диффундирует в клетке не более чем на 0,02 мкм, он способен оказывать преимущественно локальное воздействие вблизи молекул ФС. Поэтому локализация фотосенсибилизатора играет решающую роль в механизме фотоповреждения, определяя внутриклеточные и тканевые мишени, которые будут в первую очередь подвергаться фотодинамическому воздействию [46, 80, 160].

При введении в кровоток ФС связываются с сывороточными белками — альбуминами, глобулинами, липопротеинами низкой или высокой плотности,

образуя комплексы, и только небольшая часть ФС может оставаться в свободном состоянии [83, 146, 156, 187]. На возможность связывания с теми или иными сывороточными белками влияет полярность ФС. Гидрофильные фотосенсибилизаторы преимущественно связываются с альбуминами и реже — с липопротеинами низкой плотности. С увеличением гидрофобности ФС наблюдается повышение вероятности связывания красителя с липопротеинами низкой и высокой плотности [83].

Образовавшиеся комплексы ФС с белками поглощаются эндотелиальными клетками в капиллярах кровеносного русла, после чего происходит связывание красителей с адвентицией сосудов и поступление ФС в экстрацеллюлярный матрикс с последующим накоплением в клетках [83, 263].

После внутривенного введения или всасывания в кровь наибольшая концентрация фотосенсибилизатора наблюдается в печени, почках, селезенке и сердце, так как эти органы характеризуются высоким уровнем кровоснабжения и наличием капилляров фенестрированного и перфорированного типа. Далее происходит перераспределение ФС в другие органы и ткани — легкие, кишечник, желудок и кожу. Наименьший уровень накопления фотосенсибилизаторов отмечается в мышцах [22, 26, 152, 249, 255].

Пути выведения ФС из организма определяются его химической структурой. Так гидрофобные ФС преимущественно выводятся с фекалиями и c желчью через печень, гидрофильные экскретируются с мочой [66, 126, 233, 253, 270].

Повышенным сродством к накоплению ФС обладает опухолевая ткань [74, 75]. Селективность накопления ФС в опухолях связывают с рядом причин.

1. Повышенная проницаемость сосудов опухоли. Сосуды с повышенной проницаемостью представляют собой слабый барьер для большинства макромолекул, движущихся с током крови. Различия в проницаемости

30

сосудов у опухолей разных типов лежат в основе различной степени накопления фотосенсибилизаторов и, следовательно, различной степени ответа на ФДТ [99].

2. Низкий лимфатический дренаж, характерный для опухолевого участка. Снижение дренажной функции лимфатической системы способствует тому, что фотосенсибилизаторы медленнее выводятся из опухолевого участка, что приводит к их местному накоплению [136].

3.

Высокая скорость пролиферации в опухоли, при которой наблюдается высокий уровень экспрессии рецепторов липопротеинов низкой плотности, связывающих большое количество гидрофобных молекул фотосенсибилизатора [126].

4. Более низкое значение pH опухоли, чем для здоровых тканей. В качестве основной причины усиления накопления фотосенсибилизаторов при закислении среды рассматривается повышение липофильности препаратов при их протонировании [192, 240].

5. Аномальная структура опухолевой стромы, характеризующаяся

увеличенным межклеточным пространством и повышенной продукцией коллагена, который связывает порфирины [197].

6. Большое количество макрофагов в опухолевой ткани, которые являются эффективными ловушками для гидрофобных фотосенсибилизаторов [94].

Поступившие из сосудов в экстрацеллюлярный матрикс фотосенсибилизаторы могут проникать в клетку либо путем диффузии, либо с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза (клатрин- и кавеолин- зависимые пути). Большие агрегаты или частицы, содержащие ФС, могут поглощаться клеткой путем фагоцитоза [35]. В случае эндоцитоза ФС главным образом попадает в лизосомы. Конкретный способ проникновения ФС в клетку преимущественным образом зависит от размера молекул и подверженности агрегации (рисунок 6) [36]. Проникновение в клетку путем диффузии было показано для производных гематопорфирина [226], фталоцианина цинка [244], гиперицина [232], протопорфирина IX [244] и порфицена [35]. Эндоцитоз имеет место в случае N-моноаспартилхлорина e6, лизилхлорина е6 [68] и сульфированного фталоцианина аллюминия [35]. При помощи фагоцитоза проникают в клетки находящиеся в агрегированном состоянии диэфиры гематопорфирина, производные пирофеофорбида а и хлорина еб [35, 68, 144].

Рисунок 6. Пути поглощения макромолекул клетками и предельные размеры поглощающих структур: 1 — рецептор-опосредуемый эндоцитоз через покрытые клатриновые везикулы, 2 — транспорт через кавеолы, 3 — транспорт через образование везикул, в состав которых не входит ни клатрин, ни кавеолин, например, транспорт, связанный с липидными доменами (lipid rafts), 4-5 — различные типы фагоцитоза, 6 — замыкание складок мембран, которое ведет к образованию замкнутых везикул

размером до 2 мкм [36]


Перед тем, как попасть в клетку, ФС сорбируются на плазматической мембране и задерживаются в ней. Гидрофильные ФС сильнее сенсибилизируют клеточную поверхность, связываясь с мембранными белками и гликопротеинами, а липофильные — липидный бислой и гидрофобные участки интегральных или погруженных в мембрану белков

[46, 88].

Внутриклеточная локализация ФС зависит от множества факторов, среди которых: размер молекул, полярность (гидрофобность или гидрофильность), суммарный заряд и распределение заряженных групп (симметричное и ассиметричное), способность к образованию водородных связей, подверженность агрегации и т.д. (таблица 1) [35, 46, 82]. Локализация ФС в клетке также зависит от его концентрации, времени инкубации в среде, способа введения и происхождения клеток [35, 46].

Таблица 1.

Внутриклеточная локализация основных классов фотосенсибилизаторов
Коммерческое Химический Внутриклеточная
название класс/действующее вещество локализация
AlPc, Фотосенс фталоцианины/ фталоцианин митохондрии,
алюминия лизосомы [153]
ZnPc фталоцианины/ фталоцианины цинка аппарат Г ольджи, плазматическая мембрана [104]
Pc4 фталоцианины/фталоцианины

кремния

ЭПР, митохондрии [148, 242, 257]
Аласенс, Левулан, Метвикс, Аламин порфирины/протопорфирин

IX

митохондрии, цитозоль [110, 149]
Фотофрин производные

гематопорфирина/

дигематопорфирин

аппарат Гольджи, плазматическая мембрана [132]
Фоскан, mTHPC хлорины/5.10.15.20- тетракис(т-

гидроксифенилхлорин)

ЭПР, митохондриии [148, 185]
HyP гиперицин лизосомы, ЭПР [79]
NPe6 хлорины/ N-аспартилхлорин e6 лизосомы, эндосомы [211]


Митохондрии являются важными мишенями для фотодинамического воздействия. Это связано с известной ролью митохондриального повреждения в инициировании апоптоза [127]. В результате фотодинамического повреждения митохондрий ингибируется клеточное дыхание, разобщается окислительное фосфорилирование, падает митохондриальный потенциал и снижается синтез АТФ, что в итоге приводит к гибели клетки [46, 200]. В митохондриях локализуются преимущественно положительно заряженные фотосенсибилизаторы фталоцианиновой и порфириновой природы [229].

Эндоплазматический ретикулум (ЭПР) и аппарат Гольджи также считаются высокочувствительным в отношении фотодинамического воздействия [200]. В этих органеллах локализуются гидрофобные фотосенсибилизаторы, такие как гиперицин [79], фталоцианин цинка [104], производные гематопорфирина [132].

Гидрофильные отрицательно заряженные ФС преимущественно накапливаются в лизосомах. Известно, также, что большим сродством к лизосомам обладают фотосенсибилизаторы, имеющие высокую степень агрегации. Фотодинамическое воздействие приводит к разрыву лизосом и высвобождению ФС в цитозоль клетки [228].

Известно, что ФС, представляющие терапевтический интерес, не способны накапливаться в ядрах клеток [36, 201]. В то же время клеточное ядро является одной из наиболее чувствительных мишеней для активных форм кислорода [171, 217, 236, 254]. Однако ФС могут индуцировать повреждения в структуре ДНК, так как часть молекул находится в контакте с ядерной мембраной. В этом случае, фотодинамическое воздействие может вызывать образование сшивок ДНК-ДНК, ДНК-белок и повреждение хромосом [46, 48, 199].

В некоторых работах было показано, что после облучения может происходить релокализация фотосенсибилизатора, это предполагает, что помимо основного место локализации, фотоповреждение распространяется и на другие субклеточные структуры [67, 150, 151, 185].

При фотодинамическом воздействии могут реализовываться различные типы клеточной гибели: апоптоз, некроз и автофагия. Для развития апоптоза необходимо сохранение целостности плазматической мембраны и

достаточный уровень АТФ. При апототической гибели клеток происходит фрагментация ДНК, конденсация хроматина и образование апоптотических телец [46]. Этот процесс «самоуничтожения» клетки строго контролируется на уровне регуляторных белков и участвующих эффекторных ферментов. Ключевую роль в апоптозе играют протеолитические каспазы. Активация каспаз может инициироваться как снаружи, так и изнутри клетки. В первом случае запуск каспазного каскада начинается с активации одного из расположенных на клеточной мембране рецепторов, воспринимающих внешний сигнал (например, Fas, TNF, DR-4, DR-5). Во втором случае, который является наиболее вероятным при фотодинамическом воздействии, сигналы для запуска апоптоза могут исходить от митохондрий, ЭПР и лизосом [20, 21, 87]. Некроз является пассивным процессом, не требующим энергии. При некрозе наблюдается нарушение целостности и,

соответственно, проницаемости мембраны, денатурация белков, выход клеточного содержимого во внешнюю среду [1]. В случае автофагии в цитоплазме клеток происходит накопление мембранных пузырьков, которые содержат обломки органелл. При слиянии аутофагосом с лизосомами происходит образование аутофаголизосом и переваривание их содержимого [170].

Молекулярная природа ФС оказывает существенное влияние на путь клеточной гибели, индуцированной фотодинамическим воздействием. Как правило, ФС, локализующиеся в митохондриях или ЭПР, стимулируют апоптоз, в то время как ФС, расположенные в плазматической мембране или лизосомах, индуцируют некроз [147, 196].

Исследование фотодинамической активности и механизмов клеточной гибели является одним из основных начальных этапов при разработке новых препаратов для ФДТ. Вместе с тем необходимо отметить, что единого подхода для этих исследований до сих пор не разработано. Это обуславливает сложность сравнительного анализа данных различных научных групп. В настоящее время не сформулировано единых требований к используемым при работе источникам и режимам облучения. Большинство исследовательских групп использует источники широкополосного излучения, такие как газоразрядные галогеновые лампы, лампы накаливания, «белые» светодиоды [12, 58, 69, 105, 110, 112, 162, 195, 241]. У такого подхода есть ряд недостатков, важнейшим из которых является избыточная световая мощность, воздействующая на клеточную культуру, поскольку спектр излучения источников белого света в несколько раз шире спектра поглощения фотосенсибилизаторов (типичная ширина полосы поглощения около 50 нм) [85, 140, 220, 250]. Излучение, выходящее за границы этой спектральной полосы, может приводить к нежелательному нагреву клеток, побочным химическим реакциям и биологическим эффектам. Методологически более верным представляется и использование узкополосных источников, что позволяет исследовать световую активность препаратов в условиях, максимально приближенных к клиническим [40, 78, 239, 266]. Отстутствует также и унификация в отношении методов количественной оценки токсического эффекта и исследования механизмов его развития.

На уровне целого организма биологический эффект при проведении ФДТ может определяться различными механизмами. В частности, при лечении онкологических заболеваний в настоящее время рассматриваются три механизма разрушения опухолевых клеток: прямое фотоповреждение клеток, действие на сосуды и действие на иммунную систему [83].

Прямое фотоповреждение обусловлено развитием фотоиндуцированных окислительных процессов непосредственно в опухолевых клетках. По ряду причин оно не всегда приводит к полному уничтожению опухоли [90, 101, 113]. Одной из причин является неравномерное распределение красителя в опухоли. Было показано, что количество клеток, поврежденных в ходе ФДТ, снижается по мере удаления от сосуда, приносящего краситель [83]. Другой причиной является нехватка кислорода, обусловленная удаленностью участка опухоли от сосудов или его расходованием в процессе ФДТ [90, 113].

Мишенью ФДТ могут быть сосуды опухоли. В результате фотодинамического воздействия может происходить разрушение эндотелия кровеносных сосудов, активация тромбоцитов с высвобождением тромбоксана и агрегация тромбоцитов [125], образование пристеночных и окклюзирующих тромбов, сдавливание капилляров в результате

интерстициального отека [107]. Все вышеперечисленное приводит к нарушению кровотока в ткани опухоли вплоть до полного его прекращения и развитию некроза опухоли.

ФДТ может вызывать иммунный ответ. В тканях, подвергнутых ФДТ, наблюдается увеличение числа лимфоцитов, лейкоцитов и макрофагов, сопровождающих активацию иммунного ответа. В иммунном ответе на действие ФДТ участвуют такие факторы, как вазоактивные соединения, компоненты системы комплемента и каскада свертывания, протеиназы, пероксидазы, АФК, цитокины, факторы роста и другие иммунорегуляторы

[92] .

Таким образом, механизмы тканевого распределения, внутриклеточной локализации и развития биологического ответа при введении фотосенсибилизаторов сложны и до конца не изучены. Дальнейшее исследование этих механизмов необходимо для целенаправленного поиска наиболее перспективных фотосенсибилизаторов с целью оптимизации ФДТ.

<< | >>
Источник: Шилягина Наталья Юрьевна. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕТРААРИЛТЕТРАЦИАНОПОРФИРАЗИНОВ В КАЧЕСТВЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ. 2014

Еще по теме 1.2. Механизмы внутриклеточного и внутритканевого распределения фотосенсибилизаторов:

  1. Механизмы распределения централизованных фондов
  2. Шилягина Наталья Юрьевна. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕТРААРИЛТЕТРАЦИАНОПОРФИРАЗИНОВ В КАЧЕСТВЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ, 2014
  3. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ
  4. Кривая нормального распределения
  5. 4.6.3.5. Нормальное распределение
  6. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ РЕСУРСОВ
  7. Распределение ответственности
  8. Географическое распределение
  9. 6.2. Каналы распределения товаров
  10. ИЕРАРХИЯ ИНДИВИДОВ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ
  11. УВЕЛИЧЕНИЕ СЛОЖНОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И ПРОИЗВОДСТВА
  12. 3.3 РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СТОЛКНОВЕНИЙ ПО ГРУППАМ ПТИЦ
  13. Глава 7. Распределение социокультурного потенциала по типам поселений
  14. ИЗМЕНЕНИЕ ХАРАКТЕРА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ